抗體條形碼eCLIP：快速、微量、高通量的蛋白質-RNA檢測技術

2022年12月22日，來自加州大學圣地亞哥分校的Gene W. Yeo和Karen B. Chapman研究組合作在Nature Methods上以Brief Communication形式發表了題為Multiplexed transcriptome discovery of RNA-binding protein binding sites by antibody-barcode eCLIP的文章，提出了一種新的抗體條形碼eCLIP（antibody-barcode eCLIP, ABC）方法，極大提高了CLIP技術的便捷性和效率。

當前CLIP技術無法大規模應用主要存在兩個限制因素。第一，所有基于CLIP的方法都要先通過SDS-PAGE分離蛋白然后轉移到硝化纖維膜上，依據分子量大小選擇免疫沉淀的蛋白-RNA復合物。這種人工切取蛋白質-RNA復合物條帶的方法很繁瑣，需要額外的1.5-2天，并且容易受到操作者之間差異的影響。第二，每個單獨的RBP需要特定的免疫沉淀（IP）步驟，這對研究多個RBP所需的原始材料數量造成了負擔。針對以上兩個問題，研究團隊人員通過加入DNA條形碼抗體，優化了eCLIP的兩個限制，允許基于珠上近距離的連接（on-bead proximity-based ligations）取代SDS-PAGE和膜轉移步驟。此外，DNA條形碼還可以區分同一樣品中不同RBP，極大地降低了每個RBP的起始樣品量。研究人員將這種方法命名為抗體條形碼eCLIP（antibody-barcode eCLIP, ABC），具體流程如下圖。

具體地，研究人員使用兩種特征明確的RBP評估抗體條形碼eCLIP新方法，分別是RNA結合Fox-1同源物2 （RBFOX2），它識別GCAUG基序，以及莖環結合蛋白（SLBP），它與組蛋白mRNA特異性相互作用。研究結果表明抗體條形碼eCLIP和常規eCLIP得到的結果基本一致，如下圖。這也驗證了體條形碼eCLIP方法的可行性和準確性。

抗體條形碼eCLIP的一個決定性優勢是可以從單個樣本中同時檢測多個RBP，因此研究人員在K562細胞中選擇了9個先前在ENCODE3中報道過的RBP，來展示基因區域內已知結合位點的多樣性，其中包含5' UTR中的DDX3和EIF3G；3' UTR中的IGF2BP2、FAM120A、PUM2和ZC3H11A；CDS中的LIN28B；3'剪接位點的SF3B4和5'剪接位點下游的PRPF8。經過比對分析表明抗體條形碼eCLIP和單獨eCLIP方法的檢測結果相似，見下圖。

綜上所述，研究人員提出了一種稱為抗體條形碼eCLIP的新方法，在使用單一eCLIP實驗相同材料的基礎上，不僅簡化了操作流程，同時也極大增加一次性檢測RBP的通量，這將有助于樣品來源稀少，且往往投入有限的臨床標本檢測。

參考文獻

1. Ule, J., Jensen, K., Mele, A. & Darnell, R. B. CLIP: a method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells. Methods 37, 376–386 (2005).

2. Wheeler, E. C., Van Nostrand, E. L. & Yeo, G. W. Advances and challenges in the detection of transcriptome-wide protein-RNA interactions. Wiley Interdiscip. Rev. RNA 9, e1436 (2018).

3. Hafner, M. et al. CLIP and complementary methods. Nat. Rev. Methods Primers 1, 20 (2021).

4. Daniel L. et al. Multiplexed transcriptome discovery of RNA-binding protein binding sites by antibody-barcode eCLIP. Nature Methods 20, 65–69 (2023).